Nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng của cây lạc (Arachis hypogaea L.) được chuyển gen chi42.

- Đề tài không có sự trùng lặp so với các đề tài nghiên cứu đã công bố ở trong và ngoài nước. - Các nội dung trong đề tài và các kết quả được phân tích, thảo luận chi tiết và đầy đủ từ nguồn tài liệu tham khảo trong và ngoài nước theo đúng quy định. - Đề tài có ý nghĩa khoa học và đặc biệt có ý nghĩa thực tiễn cao. Đề tài đã cung cấp những dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về tối ưu hóa gen chitinase biểu hiện ở thực vật, vector chuyển gen, chuyển gen chitinase của T. asperellum vào cây lạc để tăng khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S. rolfsii gây ra, đồng thời tạo ra các dòng lạc chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Bên cạnh đó đề tài là tài liệu tham khảo phục vụ cho công tác giảng dạy, học tập, nghiên cứu khoa học. Cụ thể các kết quả chính thu được như sau: 1. Đã tối ưu được quy trình tái sinh in vitro giống lạc L14. Khử trùng hạt lạc bằng NaOCl 65% trong 10 phút, sau đó bóc vỏ và tách đôi hạt để nảy mầm. Tái sinh chồi từ các loại mẫu cấy khác nhau của cây lạc và tạo cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA. Tạo rễ cho chồi in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/L NAA. 2. Đã tối ưu hóa trình tự nucleotide gen chitinase 42 kDa của Trichoderma asperellum SH16 cho biểu hiện thực vật. Hai trình tự gen có bộ ba tối ưu hóa biểu hiện cao ở thực vật đã được đăng ký trên GenBank với các mã số là MT083802.1 (syncodChi41-1) và MT083803.1 (syncodChi41-2). Đã thiết kế thành công các vector biểu hiện thực vật mang lần lượt 3 gen chitinase (Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2) dưới sự điều khiển biểu hiện của một trong hai loại promoter: pAsy hoặc dp35S. 3. Đã biểu hiện và tinh sạch thành công chitinase có hoạt tính ở E. coli. Đồng thời đã sử dụng chitinase tinh sạch này để sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng Ta-CHI42 phục vụ phân tích Western blot. 4. Đã biểu hiện tạm thời thành công gen chitinase hoang dại (Chi42) của T. asperellum SH16 và 2 gen chitinase đã tối ưu hóa bộ ba thực vật (syncodChi41-1 và syncodChi41-2) trong cây N. benthamiana. Enzyme từ 2 gen chitinase được tối ưu đã cho thấy hoạt tính thủy phân chitin cao hơn so với enzyme từ gen chitinase hoang dại. 5. Các yếu tố thích hợp cho chuyển gen chitinase vào giống lạc L14 qua trung gian A. tumefaciens LBA4404 đã được xác định. Mẫu vật được tiền nuôi cấy 3 ngày trước khi lây nhiễm vi khuẩn, lây nhiễm 20 phút ở OD600 = 1,0 và đồng nuôi cấy mẫu vật với vi khuẩn trong tối 3 ngày trên môi trường có bổ sung acetosyringone 200 µM; mẫu chuyển gen được khử khuẩn với cefotaxime 250 mg/L và sàng lọc trên môi trường có chứa kanamycin 100 mg/L. 6. Đã biến nạp thành công 3 gen chitinase (Chi42, syncodChi42-1, và syncodChi42-2) trong vector biểu hiện thực vật pNHL19 và pNHL20 vào giống lạc L14 và tạo được 16 dòng lạc chuyển gen chitinase ở thế hệ T0. Các dòng lạc chuyển gen được kiểm tra bằng PCR, Western blot, hoạt tính chitinase và khả năng kháng S. rolfsii trong điều kiện in vitro và in vivo. Các gen đã được tối ưu syncodChi42-1 và syncodChi42-2 biểu hiện mạnh hơn gen hoang dại Chi42. Các dòng lạc chuyển gen đều có xếp hạng bệnh thấp khi xử lý S. rolfsii trong điều kiện in vivo, thay đổi từ 1 đến 1,67, trong khi đối chứng là từ 4,33 đến 5,0. 7. Đã xác định giá thể thích hợp để trồng các dòng lạc chuyển gen từ in vitro ra đất là giá thể đất mùn phối trộn cát và đá vermiculite (1:1:1). Các dòng lạc chuyển gen có thời gian sinh trưởng từ 133-144 ngày trong điều kiện nhà lưới. Các chỉ tiêu sinh lý và hóa sinh của 16 dòng lạc chuyển gen tương tự hoặc cao hơn một ít so với đối chứng không chuyển gen. - Đề tài chưa được trao giải thưởng tại Hội thi Sáng tạo Kỹ thuật và Giải thưởng Sáng tạo Khoa học Công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế và các tỉnh, thành phố khác; Chưa được trao giải thưởng tại Hội thi Sáng tạo Kỹ thuật, Giải thưởng Sáng tạo Khoa học Công nghệ toàn quốc trước thời điểm nộp hồ sơ dự thi.

- Đề tài có khả năng ứng dụng cao trong sản xuất các dòng lạc được chuyển gen chi42 có khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng nhằm tăng năng suất và hiệu quả sản xuất lạc trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và các vùng trồng lạc trong cả nước. - Các dòng lạc chuyển gen chi42 có khả năng kháng nấm cao ở thế hệ To và T1 đã được trồng ứng dụng tại vườn ươm của Viện nghiên cứu Hoạt chất sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.

Kết quả của đề tài là cơ sở để ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc nhằm nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc, góp phần bảo vệ môi trường. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của công trình được đăng tải trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế là tài liệu tham khảo có giá trị trong giảng dạy, học tập và nghiên cứu.